Х 2 10х 0: Решить уравнение!; х^2+10х=0 — Школьные Знания.com

Содержание

Cкоба каленая (1000 шт; 10х0.7 мм; Тип 53) для мебельного степлера Stelgrit 655003 — цена, отзывы, характеристики, фото

Cкоба Stelgrit 655003 является сменным элементом для степлеров. Изготовлена из углеродистой стали и закалена. Применяется для скрепления между собой различных материалов. Тип скобы — 53. Количество в упаковке — 1000 шт.

  • Длина, мм 10
  • Фасовка, шт 1000
  • Тип (классификация производителя) 53
  • Тип скоб 53/A
  • Форма тонкая
  • Ножка стандартная
  • Толщина, мм 0.7-0.75
  • Материал закаленная сталь
  • Назначение ткань/картон/тонкие деревянные планки

Этот товар из подборок

Параметры упакованного товара

Единица товара: Штука
Вес, кг: 0,09

Длина, мм: 90
Ширина, мм: 79
Высота, мм: 14

Произведено

  • Россия — родина бренда
  • Китай — страна производства*

* Производитель оставляет за собой право без уведомления дилера менять характеристики, внешний вид, комплектацию товара и место его производства.

Указанная информация не является публичной офертой

Отзывы о скобах для мебельного степлера Stelgrit каленые, 10×0,7 мм, 1000шт. 655003

Оставить свой отзыв На данный момент для этого товара нет расходных материалов

Способы получения товара в Москве

Доставка

Вес брутто товара: 0.09 кг
Габариты в упаковке, мм: 90 x 79 x 14

В каком городе вы хотите получить товар? выберите городАбаканАксайАктауАлександровАлыкельАльметьевскАнадырьАнгарскАрзамасАрмавирАрсеньевАртемАрхангельскАстраханьАхтубинскАчинскБалаковоБалашовБалезиноБарнаулБатайскБелгородБелогорскБерезникиБийскБиробиджанБлаговещенскБодайбоБокситогорскБорБорисоглебскБратскБрянскБугульмаБугурусланБуденновскБузулукВеликие ЛукиВеликий НовгородВеликий УстюгВельскВитебскВладивостокВладикавказВладимирВолгоградВолгодонскВолжскВолжскийВологдаВолховВольскВоркутаВоронежВоскресенскВыборгВыксаВышний ВолочекВязьмаВятские ПоляныГеоргиевскГлазовГорно-АлтайскГрозныйГубкинскийГусь-ХрустальныйДальнегорскДедовскДербентДзержинскДимитровградДмитровДонецкДудинкаЕвпаторияЕгорьевскЕкатеринбургЕлецЕссентукиЗаводоуковскЗеленодольскЗлатоустЗубовоИвановоИгнатовоИжевскИзбербашИнтаИркутскИшимЙошкар-ОлаКазаньКалининградКалугаКаменск-УральскийКаменск-ШахтинскийКамень-на-ОбиКанашКанскКарагандаКарасукКаргопольКемеровоКерчьКинешмаКиришиКировКиселевскКисловодскКлинКлинцыКоломнаКолпашевоКомсомольск-на-АмуреКоролевКостромаКотласКраснодарКрасноярскКропоткинКудьмаКузнецкКуйбышевКумертауКунгурКурганКурскКызылЛабинскЛабытнангиЛаговскоеЛангепасЛенинск-КузнецкийЛесосибирскЛипецкЛискиЛуневоЛюдиновоМагаданМагнитогорскМайкопМалые КабаныМахачкалаМеждуреченскМиассМинскМихайловкаМичуринскМоскваМуравленкоМурманскМуромНабережные ЧелныНадеждаНадымНазраньНальчикНаро-ФоминскНарьян-МарНаходкаНевинномысскНерюнгриНефтекамскНефтеюганскНижневартовскНижнекамскНижний НовгородНижний ТагилНовая ЧараНовозыбковНовокузнецкНовороссийскНовосибирскНовочебоксарскНовочеркасскНовый УренгойНогинскНорильскНоябрьскНурлатНяганьОбнинскОдинцовоОзерскОктябрьскийОмскОнегаОрелОренбургОрехово-ЗуевоОрскПавлодарПангодыПензаПермьПетрозаводскПетропавловскПетропавловск-КамчатскийПикалевоПлесецкПолярныйПригородноеПрокопьевскПсковПятигорскРеутовРоссошьРостов-на-ДонуРубцовскРыбинскРязаньСалаватСалехардСамараСанкт-ПетербургСаранскСарапулСаратовСаянскСвободныйСевастопольСеверныйСеверобайкальскСеверодвинскСеверскСерпуховСимферопольСлавянск-на-КубаниСмоленскСоликамскСочиСтавропольСтарый ОсколСтерлитамакСургутСызраньСыктывкарТаганрогТаксимоТамбовТаштаголТверьТихвинТихорецкТобольскТольяттиТомскТуапсеТулаТуркестанТюменьУдомляУлан-УдэУльяновскУрайУральскУрюпинскУсинскУсолье-СибирскоеУссурийскУсть-ИлимскУсть-КутУсть-ЛабинскУфаУхтаФеодосияХабаровскХанты-МансийскХасавюртЧайковскийЧебоксарыЧелябинскЧеремховоЧереповецЧеркесскЧитаЧусовойШарьяШахтыЭлектростальЭлистаЭнгельсЮгорскЮжно-СахалинскЯкутскЯлтаЯлуторовскЯрославль

Самовывоз: бесплатно

  • м. Горьковская, г. Нижний Новгород, ул. Костина, д. 13 В магазине 5 шт., забирайте сегодня В корзину
  • г. Нижний Новгород, ул. Бекетова, д. 26/1 В магазине 3 шт., забирайте сегодня В корзину
  • г. Нижний Новгород, ул. Суздальская, д. 70 В магазине >10 шт., забирайте сегодня В корзину
  • м.Буревестник, г. Нижний Новгород, ул. Коминтерна, д. 155 По предзаказу на завтра, после 18:00 В корзину
  • м.Заречная, г. Нижний Новгород, проспект Ленина, д. 45 По предзаказу на завтра, после 18:00 В корзину
  • м.Парк культуры, г. Нижний Новгород, пр-т Ленина, д. 100Д По предзаказу на завтра, после 18:00 В корзину
  • г. Нижний Новгород, ул. Бекетова, д. 26/1

    пн.  –  вс.: 9:00 – 20:00

    В корзину

  • г. Нижний Новгород, ул. Суздальская, д. 70

    пн.  –  пт.: 9:00 – 21:00

    сб.  –  вс.: 9:00 – 20:00

    В корзину

  • м.Заречная,

    г. Нижний Новгород, проспект Ленина, д. 45

    пн.  –  вс.: 9:00 – 20:00

    В корзину

  • м.Парк культуры,

    г. Нижний Новгород, пр-т Ленина, д. 100Д

    пн.  –  вс.: 9:00 – 20:00

    В корзину

Сервис от ВсеИнструменты.ру

Мы предлагаем уникальный сервис по обмену, возврату и ремонту товара!

Обратиться по обмену, возврату или сдать инструмент в ремонт вы можете в любом магазине или ПВЗ ВсеИнструменты. ру.

Гарантийный ремонт

Здесь вы найдете адреса расположенных в вашем городе лицензированных сервисных центров.

Лицензированные сервисные центры Адрес Контакты

СЦ «Тулфор» 

дер. Румянцево, стр. 1, блок А, оф. 701А  +7 (925) 288-45-99 
Может понадобиться

Лента-герметик Никобенд, 10х0,1 м, цвет красный

Вес, кг
1.67

Страна производства
Россия

Марка
НИКОБЕНД

Применение продукта
Устранение протечки кровли

Гарантия производителя (лет)
10

Тип упаковки
Без упаковки

Срок годности (в месяцах)
24

Тип продукта
Лента

Модель продукта
самоклеящаяся битумная лента-герметик

Высота (см)
10. 0

Ширина (м)
0.1

Вес на м² (кг)
1.5

Цвет
Красный

Площадь обрабатываемой поверхности (гидроизоляция) (м²)
Менее 5

Толщина (мм)
1.5

Длина (м)
10

Контрольна робота. Квадратні рівняння | Тест з алгебри – «На Урок»

Запитання 1

Укажіть рівняння, що є квадратними:

варіанти відповідей

Запитання 2

Укажіть рівняння, що є неповними квадратними рівняннями:

варіанти відповідей

Запитання 3

Укажіть рівняння, що є зведеними квадратними рівняннями:

варіанти відповідей

Запитання 4

Квадратне рівняння має 2 корені, якщо його дискримінант дорівнює:

варіанти відповідей

Запитання 5

Виберіть корені квадратного рівняння

2-9х = 0

варіанти відповідей

Коренів немає

Запитання 6

Виберіть корені квадратного рівняння

2+8 = 0

варіанти відповідей

Коренів немає

Запитання 7

(Розв’язати у зошиті)

Знайдіть корені квадратного рівняння

2-9х+6 = 0

варіанти відповідей

Коренів немає

Запитання 8

Чому дорівнює добуток коренів рівняння

х2-17х-88 = 0

варіанти відповідей

Запитання 9

(Розв’язати у зошиті)

Один із коренів рівняння х2-bx+16 = 0 дорівнює 2. Знайти другий корінь і число b.

варіанти відповідей

Запитання 10

(Розв’язати у зошиті)

Розв’язати рівняння, використовуючи теорему Вієта:

x2+10x-24 = 0

варіанти відповідей

Запитання 11

(Розв’язати у зошиті)

Знайти корені рівняння:

(х−4)2 = 2(х−4,5)

варіанти відповідей

Коренів немає

Запитання 12

(Розв’язати у зошиті)

Площа прямокутника 72 см2. Довжина прямокутника на 6 см більша за його ширину. Знайти периметр прямокутника.

варіанти відповідей

Інша відповідь

Створюйте онлайн-тести
для контролю знань і залучення учнів
до активної роботи у класі та вдома

Створити тест

Натисніть «Подобається», щоб слідкувати за оновленнями на Facebook

2-10x = 0 Tiger Algebra Solver

Пошаговое решение:

Шаг 1:

Уравнение в конце шага 1:
 ((x  3 ) - (2 • 3x  2 )) - 10x = 0
 

Шаг 2:

Шаг 3:

Вытягивание как термины:

3. 1 Коэффициенты вытягивания:

x 3 — 6x 2 — 10x = x • (x 2 — 6x — 10 )

Попытка факторизовать путем разделения среднего члена

3.2 Факторинг x 2 — 6x — 10

Первый член, x 2 , его коэффициент равен 1.
Средний член равен -6x, его коэффициент равен -6.
Последний член, «константа», равен -10

Шаг-1: Умножьте коэффициент первого члена на константу 1 • -10 = -10

Шаг-2: Найдите два множителя -10, сумма которых равен коэффициенту среднего члена, который равен -6.

-10 + 1 = -9
-5 + 2 = -3
-2 + 5 = 3
-1 + 10 = 9

Наблюдение: Нет двух таких факторов можно найти !!
Заключение: Трехчлен не может быть разложен на множители

Уравнение в конце шага 3:
 x • (x  2  - 6x - 10) = 0
 

Шаг 4:

Теория — Истоки продукта:

4. 1 Произведение нескольких членов равно нулю.

Если произведение двух или более членов равно нулю, то хотя бы одно из членов должно быть равно нулю.

Теперь мы решим каждый член = 0 отдельно

Другими словами, мы собираемся решить столько уравнений, сколько членов есть в произведении.

Любое решение term = 0 также решает product = 0.

Решение уравнения с одной переменной:

4.2 Решение: x = 0

Решение: x = 0

Парабола, поиск вершины:

4.3 Найдите вершину y = x 2 -6x-10

Параболы имеют самую высокую или самую низкую точку, называемую вершиной. Наша парабола открывается и, соответственно, имеет самую низкую точку (также известную как абсолютный минимум). Мы знаем это даже до того, как нанесли «y», потому что коэффициент первого члена, 1, положительный (больше нуля).

Каждая парабола имеет вертикальную линию симметрии, проходящую через ее вершину. Из-за этой симметрии линия симметрии, например, будет проходить через середину двух x-точек пересечения (корней или решений) параболы. То есть, если парабола действительно имеет два реальных решения.

Параболы могут моделировать множество реальных жизненных ситуаций, например высоту над землей объекта, брошенного вверх, через некоторый промежуток времени. Вершина параболы может предоставить нам информацию, например, максимальную высоту, которую может достичь объект, брошенный вверх. По этой причине мы хотим иметь возможность найти координаты вершины.

Для любой параболы Ax 2 + Bx + C координата x вершины задается как -B / (2A).В нашем случае координата x равна 3.0000

Подставив в формулу параболы 3.0000 для x, мы можем вычислить координату y:
y = 1.0 * 3.00 * 3.00 — 6.0 * 3.00 — 10.0
или y = -19.000

Parabola, Графики вершин и пересечений X:

Корневой график для: y = x 2 -6x-10
Ось симметрии (пунктирная линия) {x} = {3.00}
Вершина в {x, y} = {3.00, — 19.00}
x -Перехват (корни):
Корень 1 при {x, y} = {-1,36, 0,00}
Корень 2 при {x, y} = {7. 36, 0.00}

Решите квадратное уравнение, заполнив квадрат

4.4 Решение x 2 -6x-10 = 0, заполнив квадрат.

Добавьте 10 к обеим сторонам уравнения:
x 2 -6x = 10

Теперь умный бит: возьмите коэффициент при x, равный 6, разделите его на два, получив 3, и возведите его в квадрат, получив 9.

Добавьте 9 к обеим частям уравнения:
В правой части получим:
10 + 9 или, (10/1) + (9/1)
Общий знаменатель двух дробей равен 1 Сложение (10 / 1) + (9/1) дает 19/1
Таким образом, прибавляя к обеим сторонам, мы, наконец, получаем:
x 2 -6x + 9 = 19

Добавление 9 завершило левую часть в идеальный квадрат:
x 2 -6x + 9 =
(x-3) • (x-3) =
(x-3) 2
Вещи, которые равны одному и тому же, также равны друг другу.Поскольку
x 2 -6x + 9 = 19 и
x 2 -6x + 9 = (x-3) 2
, то согласно закону транзитивности
(x-3) 2 = 19

Мы будем называть это уравнение уравнением. # 4.4.1

Принцип квадратного корня гласит, что когда две вещи равны, их квадратные корни равны.

Обратите внимание, что квадратный корень из
(x-3) 2 равен
(x-3) 2/2 =
(x-3) 1 =
x-3

Теперь, применяя Принцип квадратного корня для уравнения.# 4.4.1 получаем:
x-3 = √ 19

Добавьте 3 к обеим сторонам, чтобы получить:
x = 3 + √ 19

Так как квадратный корень имеет два значения, одно положительное, а другое отрицательное
x 2 — 6x — 10 = 0
имеет два решения:
x = 3 + √ 19
или
x = 3 — √ 19

Решите квадратное уравнение с помощью квадратичной формулы

4.5 Решение x 2 -6x-10 = 0 по квадратичной формуле.

Согласно квадратичной формуле, x, решение для Ax 2 + Bx + C = 0, где A, B и C — числа, часто называемые коэффициентами, дается как:

— B ± √ B 2 -4AC
x = ————————
2A

В нашем случае A = 1
B = -6
C = -10

Соответственно B 2 — 4AC =
36 — (-40) =
76

Применение квадратичной формулы:

6 ± √ 76
x = —————
2

Можно ли упростить √ 76?

Да! Разложение на простые множители 76 равно
2 • 2 • 19
Чтобы иметь возможность удалить что-либо из-под корня, должно быть 2 экземпляра этого (потому что мы берем квадрат i. е. второй корень).

√ 76 = √ 2 • 2 • 19 =
± 2 • √ 19

√ 19, округленное до 4 десятичных цифр, составляет 4,3589
Итак, теперь мы смотрим на:
x = (6 ± 2 • 4,359) / 2

Два реальных решения:

x = (6 + √76) / 2 = 3 + √ 19 = 7,359

или:

x = (6-√76) / 2 = 3-√ 19 = -1,359

Было найдено три решения:

  1. x = (6-√76) / 2 = 3-√ 19 = -1,359
  2. x = (6 + √76) / 2 = 3 + √ 19 = 7,359
  3. x = 0

x² + 10x = 0 tentukan akar akarnya

Besar LC pada ABCdi samping adalah…. а. 1200C. 400b. 80 ° д. 20 ° помощь пакай чара

luas permukaan bangun pada gambar tersebut adalah … см²

дикетахуи дуа буах лингкаран денган пушат м дан н денган панджанг джари-джари мазинг-мазинг 21 см дан 3 см джика джарак MN = 30 см мака панджанг гарис сингг

ung persekutuan luar kedua lingkaran tersebut adalah

11. Keliling bangun di bawah adalah … CMA. 250.66b. 264. 96c. 272,66d. 280,96

тентукан бесар & lt; ABF!

Далам keranjang terdapat buah apel дан alpukat янг berjumlah 36 buah.Пербандинган буах алпукат дан апел адалах 4: 5. Berapakah selisih banyaknya alpu

Кат Дан Апель? 2) Seorang petugas kolam renang, sedang mengisi kolam renang dengan объем колам 43,2 м³. Setelah 6 jam kolam renang tersebut penuh. Берапа литр / детский дебет воздуха янь менгалир саат менгиси колам терсебут? 3) Сеоранг пенджахит мендапат песанан мембуат кемеджа сераган себаньяк 40 кемеджа. Джика 2 метра bahan kain dapat dibuat 5 kemeja. Berapa meter panjang bahan kain yang dibutuhkan penjait Untuk menyelesaikan pesanan tersebut? 4) Paman adalah seorang peternak bebek.Паман мемилики 21 екор бебек дан перседиан маканан бебек янь паман милики чукуп Untuk 24 хари. Kemudian paman memberseli 7 ekor bebek lagi. Берапа лама перседиан маканан бебек акан хабис? 5) Суату перушахан мемпуняй целевой продукт ян харус диселесайкан далам вакту 25 хари олех 40 оранг каряван. Пада хари ке 5 pekerjaan ditunda selama 4 хари berturutturut karena suatu hal. Джика кемампуан карьяван пабрик терсебут дианггап сама, берапаках джумлах карьяван тамбахан ян дибутухкан агар перусахан терсебут дапат менчапаи целевой продукт денган тепат вакту?

jika diket AOE + ABE + ACE + ADE = 125 ° tentukan besar AOE + ADElihat pict ya kak

Di antara pasangan himpunan di bawah ini yang merupakan pasangan yang ekuivalen adalah..a. {биланган прима куранг дари 6) дан (2, 3, 5} б. {биланган а

сли куранг дари 6} дан {2, 3, 5) в. (коэффициент dari 6} дан {2, 3, 5) d. {bilangan cacah kelipatan 3 kurang dari 9} дан {2, 3, 5} помощь

diketahui dua tabung.tabung pertama menpunyai ukuran panjang panjang jari jari 7 cm dan tinggi 30 cm, sedangkan tabung kedua mempunyai ukuran panjang j

ari jari 21 см дан tinggi 15 см .tentukan perbandingan volume tabung pertama dengan volume tabung kedua!

5 км + 3 гм + 2 плотины =…. М

Практика управления уравнениями pdf

Уравнение и получение конечного приближения к уравнению теплопроводности. Аналогичным образом этот метод применяется к волновому уравнению и уравнению Лапласа. Техника проиллюстрирована с помощью электронных таблиц EXCEL. Ключевые понятия: конечные приближения к производным, конечный метод, уравнение теплопроводности, волновое уравнение, уравнение Лапласа.

Уравнения с несколькими неизвестными могут иметь бесконечное количество решений.Например, \ (2x + y = 10 \) может быть решено следующим образом: Чтобы иметь возможность решить подобное уравнение, другое уравнение …

Институт Мизеса существует для содействия обучению и исследованиям в австрийской экономической школе, и индивидуальная свобода, честная история и международный мир в традициях Людвига фон Мизеса и Мюррея Н. Ротбарда.

В этом суть численного решения дифференциальных уравнений. Обратите внимание, что решение матричных уравнений является неотъемлемой частью численных решений дифференциальных уравнений.Оптимизация. Довольно часто в компьютерной графике мы ищем описание объекта или совокупности объектов, которые удовлетворяют какой-либо желаемой цели.

7 декабря 2020 г. · Veganarto — Распечатанные рабочие листы для понимания прочитанного для 2-го класса. Лабиринт умножения. Рабочие листы по алгебре отсутствующих углов. распечатать дошкольные рабочие листы. письменная деятельность для детского сада. математические листы сложение вычитание умножение деление. математика для 5-летних распечатанный рабочий лист. рабочие листы по первичной математике для печати.

Online Conversion — это ресурс, посвященный весам, мерам, калькуляторам, конвертерам.

манипулирование и упрощение выражений, таких как и (см. Дроби алгебры), изменение порядка формул, таких как или; решение линейных уравнений или неравенств, таких как 5x + 12 = 3 — 2x или 3 (x — 2) <7; решение квадратных уравнений, таких как (8x + 3) (x - 6) = 0, x2 + 5x - 6 = 0, 3x2 = 10x - 8 (заполнение квадрата и квадратичной формулы не требуется)

Learning Center Excel Tutorials and Практические тесты Добро пожаловать в Automate Excel! Здесь вы найдете лучшие бесплатные ресурсы по Excel и VBA в Интернете. Эта страница направит вас ко всему нашему лучшему контенту. Прокрутите страницу вниз, чтобы найти подробные описания наших 100% БЕСПЛАТНЫХ интерактивных руководств, но вы можете использовать…

Carl Zeiss Microscopy, LLC — Objective Assistant

C-Апохромат

Если вы хотите исследовать биологический образец, имеющий показатель преломления, близкий к показателю преломления воды (n = 1,33), с помощью объектива с большой апертурой, масляный объектив может дать полезный результат, только если вы не сфокусируетесь на слишком большой глубине ниже образца. поверхность.
Если вы хотите глубже вглядываться в образец, высокая сферическая аберрация сведет на нет контраст и разрешение и резко снизит яркость изображения. Последнее будет особенно заметно в конфокальной микроскопии по значительному ухудшению отношения сигнал / шум.
Следовательно, масляный объектив, каким бы хорошим он ни был, не является оптимальным для водоподобного образца. При проектировании объективов существенную роль играет показатель преломления предполагаемых образцов (и иммерсионной среды).
Масляные объективы спроектированы и исправлены в предположении, что показатели преломления иммерсионной и заливочной сред равны (n = 1,52). Для водных целей этот показатель принят равным n = 1,33 для обеих сред.
Специальные объективы:
C-Apochromat 40x и 63x с коррекцией от УФ до ИК!
Другие водно-иммерсионные объективы:
Для использования без покровного стекла:
— Объективы Achroplan® W, скорректированные для образцов без покровного стекла и для больших рабочих расстояний, особенно для использования в методах микроинъекции и патч-фиксации на вертикальных микроскопах.
— Объектив Plan-Apochromat® W 63x / 1.0 исправлен с VIS на IR.
Для использования с покровным стеклом:
— Мульти-иммерсионные объективы LCI Plan-Neofluar®, скорректированные для иммерсионных сред с показателями преломления между водой и маслом и для одинарной толщины покровного стекла.
Исследование образца водной жидкости в соответствии со строгими стандартами, например При использовании лазерного сканирующего микроскопа необходимо выполнить ряд особых требований:
? Высокая апертура для высокого разрешения в оптических шлифах и высокая яркость флуоресценции
? Большое рабочее расстояние для 3D исследований
? Низкая осевая хроматическая аберрация, чтобы фокальные плоскости разных длин волн совпадали
? Низкая боковая хроматическая аберрация, позволяющая регистрировать различные флуоресцентные изображения.
? Плоское поле для реалистичной трехмерной реконструкции
Чтобы удовлетворить этим требованиям, C-Apochromat® 40x / 1.2W Corr был разработан, чтобы иметь следующие свойства и особенности:
? Водная иммерсия водных образцов (жизненные срезы, культуры клеток, образцы с водной средой для заливки)
? Корректирующая манжета для компенсации разницы в толщине покровного стекла (0,14 … 0,18 мм) и температуре (шкала для 24 ° C и 37 ° C)
? Корректирующую манжету можно также использовать для компенсации небольших отклонений показателя преломления образца от показателя преломления воды
? Увеличение 40x
? Числовая апертура: 1. 2
? Свободное рабочее расстояние: 220 мкм
? Изображение сглажено более 25 мм (обычное) или 12 мм (конфокальное)
? Коэффициент пропускания (абсолютный): 50% при 350 нм, 85% при 400 нм, 90% при 500 … 700 нм
? Высокая хроматическая коррекция (как для объективов Plan Apochromat®)
? Отсутствие сферической аберрации в водных образцах
Предпосылки
Если заливочная и иммерсионная среды различаются по показателю преломления, оптические пути будут отличаться по длине. В зависимости от глубины фокальной точки под поверхностью образца разница будет варьироваться от незначительной до весьма заметной.По мере увеличения разности хода увеличивается и сферическая аберрация со значительными потерями в разрешении, контрастности, яркости и разрешении по глубине. Более того, измерения в осевом направлении будут ухудшаться из-за сжатия и расширения шкалы по оси Z. Чтобы исключить деформацию по Z, показатели преломления должны быть одинаковыми. Последующая компьютерная коррекция неудовлетворительна, поскольку не может компенсировать сферические аберрации. Поэтому обязательно, чтобы иммерсионная среда соответствовала образцу.
Объективы со сверхвысокой апертурой (1,2 — предел для погружения в воду) очень чувствительны к разнице в толщине покровного стекла. Поэтому C-Apochromat® 40x / 1.2W Corr имеет корректирующую манжету для компенсации толщины покровного стекла от 0,14 до 0,18 мм. Однако для достижения максимальных оптических характеристик рекомендуется использовать покровные стекла с жесткими допусками по толщине (например, 0,16 … 0,17 мм). Если объектив используется в лазерном сканирующем микроскопе, можно легко измерить толщину покровного стекла и установить коррекцию с высокой точностью.

На пути к полной и безошибочной сборке генома всех видов позвоночных

Обозначение сборки генома

Для каждой завершенной сборки особи мы дали этой сборке сокращенное имя со следующими правилами: Lineage / GenusSpecies / Individual #. . Первая буква в нижнем регистре обозначает конкретную родословную: m, млекопитающие; б, птицы; г — рептилии; а — земноводные; е — костистая рыба; а также акулы и другие хрящевые рыбы. Следующие три буквы (первые заглавные) обозначают научное название рода вида; следующие три буквы (первые заглавные) обозначают название конкретного вида. В последней позиции находится идентификатор генома, где целые числа (1, 2, 3,…) представляют разных особей одного и того же вида, а десятичные дроби (1.1, 1.2, 1.3,…) представляют разные группы одного и того же особи. Например, первая отправленная сборка курируемой колибри Анны ( Calypte anna ) — это bCalAnn1.1, а обновленная сборка для того же человека — bCalAnn1.2. Когда сокращенные названия линий или родов и видов для двух или более видов были идентичны, мы заменяли последующие буквы (четвертую, пятую и т. Д.) В названии рода или вида до тех пор, пока они не могли быть дифференцированы. Мы создали сокращенные названия для всех 71 657 видов позвоночных (http://vgpdb.snu.ac.kr/splist/; https://id.tol.sanger.ac.uk/).

Сбор образцов

Производство высококачественных геномных сборок потребовало от нас получения высококачественных клеток или тканей, которые позволили бы получить ДНК с высокой молекулярной массой (HMW) для технологий долгого секвенирования (CLR и ONT) и оптического картирования (Бионано). Поэтому были получены свежезамороженные образцы различных тканей (дополнительная таблица 8). Все образцы были получены в соответствии с утвержденными протоколами соответствующих комитетов по уходу за животными и использованием или разрешениями, полученными соответствующими лицами и учреждениями, перечисленными в дополнительной таблице 8. Дополнительные сведения об образцах находятся на соответствующих страницах BioSample (https: //www.ncbi) .nlm.nih.gov / biosample; инвентарные номера в дополнительной таблице 8). Все протестированные типы тканей дали достаточное количество и качество ДНК для секвенирования и сборки, но мы обнаружили, что кровь лучше всего подходит для видов, у которых есть ядра эритроцитов (то есть птиц и рептилий), а селезенка или культивированные клетки лучше всего подходят для млекопитающих. , по состоянию на сегодняшний день.Анализ различных типов тканей будет представлен в другом месте (в процессе подготовки).

Выделение высокомолекулярной ДНК

Выделение ДНК из агарозной пробки

Для тканей ДНК HMW экстрагировали с использованием протокола выделения ДНК из волокнистой ткани Bionano (каталожный номер RE-013-10; номер документа 30071), в соответствии с рекомендациями производителя. Всего 25–30 мг фиксировали в 2% формальдегиде и гомогенизировали с помощью Qiagen TissueRuptor или ручного разрушения тканей.Для ядерной крови использовали 27–54 мкл с адаптированным протоколом (Bionano, личное сообщение) набора Bionano Prep для выделения ДНК крови и клеточных культур (каталожный номер RE-130-10). Лизаты помещали в агарозные пробки и обрабатывали протеиназой К и РНКазой А. Затем пробки очищали капельным диализом с 1 × ТЕ. Качество ДНК оценивали с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) (Pippin Pulse, SAGE Science, Беверли, Массачусетс) или прибора Femto Pulse (Agilent). PFGE показал, что мы выделили ДНК сверхвысокой молекулярной массы от ~ 100 до ~ 500 т.п.н.

Экстракция фенол-хлороформной гДНК

Для некоторых образцов мы провели фенол-хлороформную экстракцию для HMW-гДНК. Замороженную ткань измельчали ​​в тонкий порошок пестиком в ступке в жидком азоте. Порошкообразную ткань лизировали в течение ночи при 55 ° C в буфере для лизиса тканей с высоким содержанием соли (400 мМ NaCl, 20 мМ трис-основания (pH 8,0), 30 мМ EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 100 мкг / мл протеиназы K). и порошкообразную ткань легких лизировали в течение ночи в буфере для лизиса Qiagen G2 (каталожный номер 1014636, Qiagen, Hilden, Германия), содержащем 100 мкг / мл протеиназы K, при 55 ° C.РНК удаляли инкубацией в 50 мкг / мл РНКазы A в течение 1 ч при 37 ° C. ГДНК HMW очищали двумя промывками смесью фенол-хлороформ-ИУК, уравновешенной до pH 8,0, с последующими двумя промываниями смесью хлороформ-ИУК и осаждали ледяным 100% этанолом. Нитевидную гДНК HMW либо наматывали с помощью пастушьих крючков, либо собирали центрифугированием. ГДНК HMW дважды промывали 70% этанолом, сушили в течение 20 мин при комнатной температуре и элюировали ТЕ. Для образца гДНК мышцы летучего цихлиды, используемого для библиотек PacBio CLR и 10XG, гликоген осаждали добавлением 1/10 (об. / Об.) 0.3 М ацетат натрия, pH 6,0, для экстрагированной геномной ДНК, осторожное перемешивание и центрифугирование при комнатной температуре при 10 000 г . PFGE выявил, что длина молекулы ДНК составляет от 50 до 300 т. п.н. — часто меньше, чем размер, полученный с помощью агарозной пробки, но достаточной для долгосрочного секвенирования CLR и связанных типов данных чтения.

Другое

Мы также использовали набор ДНК Qiagen MagAttract HMW (каталожный номер 67563) и набор KingFisher Cell and Tissue DNA (Thermo Scientific; каталожный номер 97030196), следуя рекомендациям производителей.Эти протоколы дали ДНК HMW в диапазоне от 30 до 50 т.п.н. Набор Genomic Tip (Qiagen) также использовался для тканевой экстракции ДНК HMW.

Библиотеки и секвенирование

Библиотеки PacBio и секвенирование

ДНК, полученная из агарозных пробок, была разрезана до размера фрагмента ~ 40 т.п.н. с помощью устройства MegaRuptor (Diagenode, Бельгия) и фрагментирована с использованием пробирок Covaris g (520079) или с помощью ножниц . Большие библиотеки вставок PacBio были подготовлены с помощью набора SMRTbell Template Prep Kit 1.0-SPv3 (номер 100-991-900) или набор для подготовки шаблона SMRTbell Express v1 (номер 101-357-000). Библиотеки были выбраны по размеру от 12 до 25 т.п.н. с использованием Sage BluePippin (Sage Science, США) в зависимости от качества ДНК и метода экстракции. Эти библиотеки секвенировали на инструментах RSII или Sequel I, по крайней мере, с 60-кратным охватом для каждого вида с использованием набора для связывания Sequel и планшета для секвенирования версий 2.0 и 2.1 с 10-часовым киносеансом (дополнительная таблица 9).

10X Chromium библиотеки и секвенирование

Нефрагментированная HMW ДНК из агарозных пробок была использована для создания связанных библиотек чтения на платформе 10X Genomics Chromium (Genome Library Kit и Gel Bead Kit v2 PN-120258, Genome Chip Kit v2 PN-120257, i7 Multiplex Kit PN-120262) в соответствии с рекомендациями производителя.Мы секвенировали 10-кратные библиотеки при ~ 60-кратном охвате для каждого вида на дорожке PE Illumina NovaSeq S4 длиной 150 п.н.

Библиотеки Bionano и визуализация оптических карт

Нефрагментированная ультра-HMW ДНК из агарозных пробок была помечена с использованием либо двух разных колющих ферментов (BspQI и BssSI), либо фермента прямого мечения (DLE1) в соответствии с NLRS Bionano Prep Labeling (номер документа 30024). ) и протоколы DLS соответственно (номер документа 30206). Затем меченые образцы отображали на приборе Bionano Irys или Bionano Saphyr.Для всех видов мы стремились обеспечить как минимум 100-кратное покрытие на этикетке (дополнительная таблица 9).

Библиотеки Hi-C и секвенирование

Библиотеки взаимодействия хроматина (Hi-C) были созданы с использованием библиотек Arima Genomics, Dovetail Genomics или Phase на мышцах, крови или других тканях с перекрестным связыванием in vivo (дополнительная таблица 9) и секвенсированы на инструментах Illumina. Препараты Arima-HiC были выполнены Arima Genomics (https://arimagenomics.com/) с использованием набора Arima-HiC, который использует два фермента (P / N: A510008).Полученную проксимально лигированную ДНК Arima-HiC затем разрезали, отбирали по размеру около 200-600 п.н. с использованием гранул SPRI и обогащали биотин-меченной близкослигированной ДНК с использованием гранул стрептавидина. Из этих фрагментов были созданы библиотеки, совместимые с Illumina, с использованием набора KAPA Hyper Prep (P / N: KK8504). Полученные библиотеки амплифицировали с помощью ПЦР и очищали с помощью гранул SPRI. Качество конечных библиотек проверяли с помощью кПЦР и биоанализатора, а затем секвенировали на Illumina HiSeq X при ~ 60-кратном охвате в соответствии с протоколами производителя.Препараты «Ласточкин хвост-HiC» были выполнены «Ласточкин хвост» с использованием метода бесконтактного лигирования с одним ферментом (DpnII). Библиотеки Phase-HiC были созданы Phase Genomics с использованием одноферментной реакции Proximo Hi-C Library.

Контроль качества

Перед выполнением любой сборки все геномные данные всех типов данных из каждого образца были использованы для скрининга библиотек с потенциальными выбросами, запусков последовательностей с выбросами или случайного контаминации видами с помощью Mash 73 путем измерения сходства последовательностей (дополнительный рис. .4). При запуске Mash мы использовали 21-мерную модель для создания эскизов с размером эскиза 10 000 и сравнивали между каждым циклом секвенирования, а затем оценивали различия между наборами секвенирования.

Оценка размера генома, содержания повторов и гетерозиготности

Эти оценки были сделаны с помощью методов на основе k , примененных к коротким считываниям Illumina, полученным из связанных библиотек секвенирования 10XG. После обрезки штрих-кодов во время предварительной обработки scaff10x 74 канонические 31-мерные числа были собраны с использованием Meryl 23 .С полученной 31-мерной гистограммой GenomeScope 71 использовали для оценки длины гаплоидного генома, содержания повторов и гетерозиготности. Данные чтения, связанные с тернистым коньком, не прошли контроль качества, что, как мы подозреваем, было связано с низкой сложностью последовательностей из-за высокого содержания повторов (54,1%) в геноме; Таким образом, k -меров были собраны позже из считываний полногеномного секвенирования Illumina. Размер генома и содержание повторов канальной собачки были оценены с помощью альтернативного метода, который рассматривает режим перекрытия длинного чтения и WindowMasker 75 , поскольку предполагаемый размер генома из GenomeScope почти вдвое превышал известный размер гаплоидного генома (1 . 29 Гб против 0,6 Гб) и повторяющееся содержание (28,0% против 58,0%) по причинам, связанным либо с качеством данных 10X, либо с различиями видов.

Сравнительный анализ этапов сборки с колибри Анны

Для разработки стандартного конвейера VGP мы сравнили различные строительные леса, инструменты для заполнения зазоров и полировки. Если не указано иное, использовались параметры по умолчанию. Подробные версии программного обеспечения перечислены в дополнительной таблице 2.

Contigging and scaffolding

FALCON 76 и FALCON-Unzip 17 (smrtanalysis 3.0.0) были использованы для генерации контигов, использующих CLR. Canu 77 1.5 + 67 был использован для создания комбинированной сборки PacBio CLR и Oxford Nanopore ONT. Для тестирования скаффолдинга со связанными чтениями мы использовали scaff10x 74 2.0. Для связанной сборки, доступной только для чтения, использовалась Supernova 2 78 . Для оптических карт в программном обеспечении Bionano Solve v3. 2.1 использовались гибридные каркасы с двумя ферментами, первоначально с использованием BspQI и BssSI, а также DLE1 позже, когда была разработана технология. Для тестирования Hi-C в строительных лесах, Salsa 2.2 79 был использован для результатов построения каркаса на рис. 1а с считываниями Hi-C, сгенерированными из Arima Genomics. Дополнительные сравнения для библиотек Hi-C были выполнены с использованием сборок, предоставленных Dovetail Genomics и Phase Genomics (дополнительная таблица 3). Мы использовали Hi-C от Arima Genomics, поскольку он имел наименьшее количество дубликатов ПЦР и лучший охват для коротких и длительных взаимодействий во время сравнения (дополнительный рисунок 1). Статистика сборки HiRise, Proximo HiC, 3D-DNA 80 и Arima Hi-C доступна в дополнительной таблице 3.Мы пришли к выводу, что все алгоритмы построения лесов Hi-C имеют одинаковую производительность. Мы решили использовать Salsa, поскольку HiRise и Proximo HiC не были открытым доступом, а 3D-ДНК требовала больших вычислительных ресурсов на платформе DNAnexus. Для сборок с коротким чтением, отличных от сборки Supernova и NRGene, для тестирования использовалась сборка GCA_000699085.1 16 , которая была сгенерирована с помощью парных библиотек Illumina, библиотеки с несколькими сопряженными парами и ассемблера SoapDeNovo 81 . Сборка NRGene была предоставлена ​​компанией DeNovo Magic.

Заполнение пробелов

Мы запустили PBJelly с параметрами —capturedOnly —spanOnly, чтобы избежать жадного закрытия пробелов без поддержки чтения охвата. Для последовательностей с консервативным заполнением мы сравнили различные параметры в выходном каскаде с —minreads 1 и —minreads 4 в дополнение к отсутствию ограничений. Мы обнаружили, что количество закрытых зазоров было таким же, как количество закрытых зазоров, заполненных стрелкой 76 (дополнительная таблица 4), и решили не запускать PBJelly 82 для будущих сборок.

Полировка с коротким считыванием

Тестирование полировки Illumina было выполнено с использованием Longranger 83 2. 1.3 и Pilon 84 1.21 с базами —fix, локальная опция (дополнительная таблица 5). Позже, для конвейера VGP, мы использовали FreeBayes 85 , поскольку Pilon 84 нельзя было масштабировать с вычислительной точки зрения для больших геномов с обновленным Longranger 2.2.2.

Оценка точности базового уровня

Точность базового уровня была измерена с использованием подхода, основанного на отображении, а затем с использованием подхода k на основе числа людей 23 .Чтобы определить количество раундов для полировки, мы использовали парные чтения Illumina с колибри 16 .

Ошибочные и пропущенные присоединения

Курируемая сборка колибри была сопоставлена ​​с целевыми сборками с помощью MashMap2 86 с —filter_mode one-to-one —pi 95 с использованием сегментов размером 5 КБ (-s 5000) для CLR сборок и 1 кб (-s 1000) для сборок SR для компенсации более коротких размеров контигов, поскольку контиги, меньшие размера сегмента, будут исключены из выравнивания. Количество ошибочных и пропущенных соединений было определено с помощью файла assembly_comparison.pl, который использовался в разделе «Курирование» ниже (Дополнительные методы, дополнительный рисунок 5).

Стандартный конвейер сборки генома VGP от 1,0 до 1,6

Все 17 геномов были собраны с помощью конвейера VGP (расширенные данные, рис. 2a) для эталонных целей, при этом некоторые из них не были обработаны. С помощью конвейера VGP были сгенерированы бледные копьеносые летучие мыши, большие подковоносы, канадская рысь, утконос, самец и самка зебрового зяблика, какапо, колибри Анны, терновая черепаха Гуда, летучая цихлида и тупоносая морская рыба-рыба.0–1,6 и курируется для отправки в публичные архивы NCBI и EBI. Кураторские и представленные сборки двухрядного слепня, зигзагообразного угря, морского окуня, канальной собачки, восточного хэппи и тернистого ската были созданы с использованием аналогичного процесса, разработанного параллельно (дополнительное примечание 2). Были созданы две представленные кураторские версии самки зебрового вьюрка: одна с использованием стандартного конвейера VGP, а другая — с использованием конвейера VGP trio, чтобы другие могли провести сравнительный анализ.

Contigging

Для данных PacBio контиги были сгенерированы из субпотоков с использованием FALCON 76 и FALCON-Unzip 17 с одним раундом полировки Arrow (smrtanalysis 5.1.0.26412). Использовалась минимальная длина чтения 2 кб или порог, при котором считывания длиннее порогового значения, включая 50-кратное покрытие, в зависимости от того, что больше. Для расчета охвата чтения мы использовали предполагаемый размер генома из http://www.genomesize.com/, если он доступен, или из литературы (дополнительная таблица 11), ожидая секвенирования 10XG для оценки размера генома с использованием k -меров. FALCON и FALCON-Unzip запускались с параметрами по умолчанию, за исключением вычисления перекрытий. Необработанные перекрытия при чтении вычислялись с параметрами DALIGNER -k14 -e0.75 -s100 -l2500 -h340 -w8, чтобы лучше отразить более высокую частоту ошибок в ранних сиквелах PacBio I и II. Перекрытия Pread (предварительно собранного чтения) вычислялись с параметрами DALIGNER -k24 -e. 90 -s100 -l1000 -h600, предназначенными для коллапса гаплотипов для этапа FALCON, чтобы лучше распаковать геномы с высокой степенью гетерозиготности. FALCON-Unzip выводит как псевдогаплотип, так и набор альтернативных гаплотигов, которые представляют вторичные аллели. Мы называем эти выходы первичным набором контигов (c1) и альтернативным набором контигов (c2).

Удаление ложных дупликаций

Гетеротипные ложные дупликации произошли, несмотря на установку параметров FALCON 76 для устранения расхождения гаплотипов до 10%. FALCON-Unzip 17 также неправильно сохранил некоторые вторичные аллели в первичном наборе контигов, которые выглядели как ложные дупликации. Чтобы уменьшить эти ложные дублирования, мы запустили Purge_Haplotigs 13 сначала во время курирования (конвейер VGP v1.0), а затем позже после формирования контигов (конвейер VGP v1.5).Чтобы сделать первое, Purge_Haplotigs запускали на первичных контигах (c1), и идентифицированные гаплотиги были сопоставлены с первичной сборкой каркаса с помощью MashMap2 86 для удаления. В последнем случае идентифицированные гаплотиги были перемещены из первичных контигов (c1) в альтернативный набор гаплотигов (p2). Остальные первичные контиги были обозначены как p1; p2 в сочетании с c2 обозначается как q2. Позже, в конвейере VGP v1.6, мы заменили Purge_Haplotigs на Purge_Dups 14 , новую программу, разработанную несколькими авторами в ответ на то, что Purge_Haplotigs не удаляет частичное ложное дублирование на границах контигов.Очистка также удаляет излишние контиги с низким покрытием (мусор) и высоким покрытием (повторы). Чтобы рассчитать наличие и общий успех очистки ложных дупликаций, мы использовали подход k -mer (дополнительные методы, дополнительный рис. 6).

Каркас со связанными чтениями 10XG

Связанные чтения 10X Genomics были выровнены с первичными контигами (p1), и матрица смежности была вычислена из штрих-кодов с использованием scaff10x 74 v2.0–2.1. Выполнено два раунда возведения лесов.Первый цикл был запущен с параметрами -matrix 2000 -reads 12 -link 10, а второй этап — с параметрами -matrix 2000 -reads 8 -link 10. Между соединенными контигами был вставлен промежуток в 100 bp (обозначенный буквами «N»). Полученный первичный набор каркасов был назван s1.

Строительные леса с оптическими картами Bionano

cmaps Bionano были сгенерированы с использованием конвейера Bionano в режиме негаплотипной сборки и использованы для дальнейшего каркаса сборки s1 с помощью Bionano Solve v3.2.1 87 .Мы начали с одноферментной ник-карты (BspQI), за которой последовала ник-карта с двумя ферментами (BspQI и BssSI), а затем с подходом, не связанным с одним ферментом DLE-1, когда стали доступны более поздние типы данных (дополнительные Таблица 9). Промежутки в каркасе были рассчитаны в соответствии с оценкой программного обеспечения. Полученный набор каркасов был назван s2.

Строительные леса с Hi-C чтениями

Hi-C чтения были выровнены с каркасами s2 с помощью конвейера картирования Arima Genomics 88 . Вкратце, оба конца пары чтения были сопоставлены независимо с помощью BWA-MEM 89 с параметром -B8 и отфильтрованы, когда качество сопоставления было <10. Химерные чтения, содержащие сайт рестрикционного фермента, отсекали от рестрикционного сайта и далее, оставляя только 5′-конец. Затем отфильтрованные сопоставления с одним считыванием были повторно объединены как сопоставления с парным считыванием. Обработанные выравнивания затем использовали для построения каркаса с помощью Salsa2 79 , который анализирует нормализованную частоту взаимодействий Hi-C между всеми парами концов контигов, чтобы определить вероятный порядок и ориентацию каждого из них. Мы использовали параметры -m yes -i 5 -p yes, чтобы позволить Salsa2 разбивать потенциально неправильно собранные контиги и выполнять пять итераций каркаса.После получения отзывов от курирования были разработаны более поздние версии сальсы, которые более консервативно определяют количество итераций (v2.1) и активно ломаются при неправильной сборке (v2.2), а также работают для канадской рыси, черепахи Гуда и двухъярусный цецилион. Ферменты рестрикции, используемые для создания каждой библиотеки, были указаны с использованием параметров -e GATC, GANTC для Arima и -e GATC для данных Dovetail и Phase Genomics Hi-C. Полученная сборка строительных лесов Hi-C была названа s3.

Полировка консенсуса

Для полировки оснований в обоих гаплотипах с минимальным смещением выравнивания мы объединили альтернативный набор гаплотигов (c2 в v1.0 или q2 в v1.5–1.6) в каркасный первичный набор (s3) и собранный митохондриальный геном (mitoVGP в v1.6). Затем мы выполнили еще один раунд полировки с помощью Arrow (smrtanalysis 5.1.0.26412) с использованием считываний PacBio CLR, согласовав с pbalign —minAccuracy = 0,75 —minLength = 50 —minAnchorSize = 12 —maxDivergence = 30 –concordant —algorithm = blasr —algorithmOptions = — useQuality —maxHits = 1 —hitPolicy = random —seed = 1 и полировка консенсуса с помощью optionCaller —skipUnrecognizedContigs haploid -x 5 -q 20 -X120 –v —algorithm = arrow.Хотя этот раунд полировки привел к более высокому QV для всех рассмотренных здесь геномов, мы заметили, что он был особенно чувствителен к параметру отсечения покрытия (-x). Это связано с тем, что Arrow генерирует консенсус de novo из сопоставленных операций чтения без явного учета эталонной последовательности. Позже мы обнаружили, что второй этап полировки Arrow иногда снижал точность QV для некоторых видов. После расследования эта проблема была обнаружена до опции -x 5, которая требует не менее 5 чтений для вызова консенсуса.Такие низкие минимальные требования могут привести к неравномерной полировке в областях с низким покрытием. Чтобы избежать этого поведения, мы предлагаем увеличить -x близко к охвату половинной последовательности (например, 30 ×, когда для сборки использовалось 60 ×) и проверить QV перед тем, как двигаться дальше.

Для геномов с объединенным размером сборки более 4 Гб мы использовали Minimap2 90 с параметрами -ax map-pb вместо Blasr 91 , чтобы преодолеть ограничения размера ссылочного индекса.

Были выполнены еще два раунда полировки пар оснований со связанными считываниями.Показания были выровнены с помощью Longranger align 2.2.2, который включает Lauriat для выравнивания с учетом штрих-кода 83 . Из сопоставлений гомозиготные несовпадения (варианты) были вызваны с помощью FreeBayes 83 v1. 2.0 с использованием параметров по умолчанию. Консенсус был вызван консенсусом bcftools 92 с -i’QUAL> 1 && (GT = ’’ AA ’’ || GT = ‘’ Aa ’’) ’-Hla.

VGP Trio Pipeline v1.0 – v1.6

Конвейер trio спроектирован аналогично стандартному конвейеру, за исключением использования родительских данных (расширенные данные рис.3б). Когда доступны родительские геномы, чтения CLR ребенка объединяются с материнскими и отцовскими гаплотипами и собираются отдельно как контиги, специфичные для гаплотипа (гаплотиги), с использованием TrioCanu 20 . Вкратце, родительский специфический маркер k -меров собирали с использованием Meryl 23 из родительских считываний Illumina WGS родителей. Эти маркеры были отфильтрованы и использованы для сортировки чтения CLR ребенка. Гаплотип был назначен с учетом наблюдаемых маркеров, нормализованных по общим маркерам в каждом гаплотипе.Последующие этапы очистки, сборки и полировки были аналогичным образом обновлены с использованием Purge_Dups 14 (v1. 6). Мы расширили биннинг на связанные чтения и чтения Hi-C, исключив пары чтения, которые имели какой-либо родительский маркер. Бинированные считывания Hi-C использовали для каркаса его сборки гаплотипа и полировали объединенными связанными считываниями из наблюдения за переключением гаплотипов с использованием стандартного подхода полировки. Во время курирования в качестве репрезентативного гаплотипа была выбрана одна из сборок гаплотипов с более высоким QV и / или смежностью.Гетерогаметная половая хромосома из невыбранного гаплотипа была добавлена ​​в репрезентативную сборку. Однако при изучении нескольких трио мы обнаружили, что в регионах с низким расхождением между общими родительскими гомогаметными половыми хромосомами (то есть X или Z) небольшая часть данных CLR потомков была ошибочно отнесена к неправильному гаплотипу. Это неправильное выравнивание привело к дублированию сборки X или Z потомства с низким охватом в отцовском (для млекопитающих) или материнском (для птиц) гаплотипе, соответственно, что потребовало удаления во время культивирования. Мы работаем над методами повышения точности биннинга для решения этой проблемы в будущем.

Для самки зебра вьюрка, в частности, контиги были сгенерированы до того, как объединение было автоматизировано в ассемблере Canu как TrioCanu1.7, и поэтому был применен процесс объединения вручную, как описано в исходной статье Trio-binning 20 (Дополнительные методы ). Контиги были собраны для каждого гаплотипа с использованием разделенных чтений, за исключением неклассифицированных чтений. Контиги были отполированы двумя циклами полировки Arrow с использованием разбитых считываний и построены в соответствии с v1.0 трубопровод без продувки. Были применены дополнительные раунды строительных лесов с Bionano (s4) и Hi-C. Каркасы были переименованы в соответствии с первичной сборкой каркасов одного и того же индивидуума (s5), при этом половые хромосомы сгруппированы как Z в отцовской сборке и W в материнской сборке после синтении с Z-хромосомой из курируемой сборки VGP самца зябликов. Были применены два раунда полировки SR с использованием связанных чтений путем картирования на обоих гаплотипах. После того, как были обнаружены переключатели гаплотипов, были применены дополнительные раунды полировки с использованием бинированных связанных чтений (дополнительные методы).

Сборка митохондриального генома

Подобно другим недавним методам 93,94 , мы разработали конвейер сборки МТ на основе контрольных образцов. Считывания MT в необработанных данных CLR были идентифицированы путем сопоставления всего набора считываний с существующей эталонной последовательностью конкретных видов или близкородственных видов с помощью Blasr. Отфильтрованные CLR мтДНК были собраны в один контиг с помощью Canu v1.8, отполированы с помощью Arrow с помощью CLR, а затем FreeBayes v1.0.2 вместе с bcftools v1.9 с использованием коротких считываний данных 10XG (расширенные данные, рис.3в). Перекрывающиеся последовательности на концах контига были обрезаны, а оставшаяся последовательность контигов сделана циркуляризованной. Конвейер mitoVGP доступен по адресу https://github.com/VGP/vgp-assembly/tree/master/mitoVGP. Более подробное описание протокола сборки конвейера и новых открытий из сборок MT опубликовано в другом месте 33 .

Curation

Конвейер сборки генома VGP производит высококачественные сборки, но до сих пор ни один автоматизированный метод не свободен от ошибок, особенно на этапах создания каркасов.Чтобы свести к минимуму влияние оставшихся алгоритмических недостатков, мы подвергли все сборки тщательной ручной обработке. Все данные, полученные для вида в этом исследовании, и другие общедоступные данные (например, генетические карты, наборы генов и сборки генома одного и того же или близкородственных видов) были сопоставлены, согласованы с первичной сборкой и проанализированы в gEVAL 95 ( https://vgp-geval.sanger.ac.uk/index.html), визуализируя несоответствия в браузере функций и списках проблем. Параллельно данные Hi-C были сопоставлены с первичной сборкой и визуализированы с помощью Juicebox 96 и / или HiGlass 97 . С помощью этих данных кураторы генома определили неправильные соединения, пропущенные соединения и другие аномалии и соответствующим образом скорректировали первичную сборку. Никаких изменений не было сделано без недвусмысленных свидетельств имеющихся типов данных; например, предлагаемое соединение Hi-C не будет выполнено, если оно не поддерживается картами BioNano, данными длительного считывания или выравниванием генов. При секвенировании гетерогаметного пола мы определили половые хромосомы на основе половинного покрытия, выравнивания гомологии с половыми хромосомами у других видов и наличия генов, специфичных для половых хромосом.

Удаление загрязнений

Для выявления потенциальных загрязнителей в сгенерированных сборках была использована последовательность поисков.

1) Поиск megaBLAST 98 в базе данных распространенных загрязнителей (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/kitts/contam_in_euks.fa.gz), требующий e ≤ 1 × 10 -4 , сообщают о совпадениях с ≥98% идентичности последовательностей и длиной совпадения 50–99 п. н., ≥94% и длиной совпадения 100–199 п.н., или ≥90% и длиной совпадения 200 п.н. или выше.

2) Векскрин (https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) поиск по базе данных последовательностей адаптеров (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/kitts/adaptors_for_screening_euks.fa)

3) После софт- маскирование повторов с использованием Windowmasker 75 , поиск megaBLAST по сборкам хромосомного уровня из RefSeq, требующий e ≤ 1 × 10 −4 , оценка соответствия ≥100 и идентичность последовательности ≥98%; области, соответствующие высококонсервативным рДНК, игнорировались.

Ручная проверка результатов была необходима, чтобы отличить контаминацию от консервации и / или горизонтального переноса генов.Последовательности адаптеров были замаскированы; другие последовательности загрязнителей были удалены. Сборки также были проверены на наличие пробегов N на концах каркасов, созданных как артефакты итеративного процесса построения каркасов, и при обнаружении они были обрезаны.

Геномы органелл

Они были обнаружены с помощью поиска megaBLAST в базе данных известных геномов органелл, требующих e ≤ 1 × 10 −4 , идентичность последовательностей ≥90% и длина совпадения ≥500; базы данных доступны по адресу ftp: // ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/mito.nt.gz и ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid/*genomic.fna.gz. Предполагалось, что только каркасы, полностью состоящие из последовательностей органелл, являются геномами органелл и заменены геномом из отдельного конвейера сборки органелл. Соответствующие органеллы, встроенные в ядерные последовательности, которые оказались NuMT, сохранялись.

Удаление ложной дупликации

Сохраненные ложные дупликации были идентифицированы с помощью Purge_Haplotigs 13 прогона либо после возведения строительных лесов и полировки (колибри Анны, какапо, самец зебрового зяблика, самка зебрового зяблика, утконос, бледная летучая мышь с копьевидным носом и большая подковообразная летучая мышь) или на c1 до строительных лесов (двухрядный цецилий, летучая цихлида, канадская рысь и черепаха с шипами Гуда). Последующее ручное курирование выявило дополнительные гаплотипические дупликации для перечисленных сборок, а также тех, которые не обрабатывались Purge_Haplotigs (восточный хэппи, альпинистский окунь, зигзагообразный угорь). Использованные доказательства включали охват считыванием, самосравнение последовательностей, выравнивание транскриптов, выравнивание карты Bionano и двухмерные карты Hi-C, которые подтверждали избыточную природу одного аллеля. Выявленные дупликации гаплотипов были перемещены из первичной сборки в альтернативную.

Присвоение хромосом

Для аннотирования каркаса как хромосомы мы использовали данные Hi-C, а также данные о генетическом сцеплении или картирование кариотипа FISH, если таковое имеется.Для доказательства Hi-C мы рассматривали каркас как полную хромосому (хотя и с пробелами), когда на графиках Juicebox или HiGlass была четкая непрерывная диагональ для этого каркаса и не было других больших каркасов, которые можно было бы присоединить к тому же каркасу; если он присутствует и однозначное соединение невозможно, мы назвали его нелокализованным каркасом для этой хромосомы. Когда мы не могли найти доказательств наличия полной хромосомы, мы сохранили номер каркаса для его названия. Мы назвали все подтвержденные доказательствами каркасы хромосомами с наименьшим разрешением Hi-C-боксов, допускаемым этими характеристиками.Когда существовала установленная хромосомная терминология для данного вида или набора видов, мы используем установленную терминологию, за исключением случаев, когда наши новые сборки выявляли ошибки в старой сборке, такие как слияние каркаса / хромосомы, деления, перестройки и нехромосомных названий. Для видов без установленной хромосомной терминологии мы назвали каркасы номерами хромосом 1, 2, 3… в порядке убывания размера каркаса. Для половых хромосом мы использовали буквы X и Y для млекопитающих и Z и W для птиц.

Использование сравнительной геномики для оценки структуры сборки

В случаях, когда высококачественный геном на уровне хромосом был доступен для близкородственных видов, был проведен сравнительный анализ генома. Полированная первичная сборка (t3. p) была сопоставлена ​​со связанным геномом с помощью MashMap2 86 с —pi 75 -s 300000. Количество хромосомных различий было определено с помощью специального скрипта, доступного на https://github.com/ jdamas13 / assembly_comparison. Это привело к идентификации от ~ 60 до ~ 450 регионов для каждой сборки генома, фланкирующих предполагаемые неправильные сборки или клон-специфические перестройки генома.Чтобы определить, какие из них были настоящими неправильными сборками, выявленные несоответствия были переданы группе курирования для ручной проверки (см. Выше).

Чтобы идентифицировать любые возможные оставшиеся неправильные соединения, каждую курируемую сборку птиц и млекопитающих сравнивали с геномами зебрового зяблика (taeGut2) или человека (hg38) соответственно. Попарное выравнивание между каждой из сборок VGP и эталоном клады было произведено с помощью LastZ 99 (версия 1.04) с использованием следующих параметров: C = 0 E = 30 H = 2000 K = 3000 L = 2200 O = 400. Попарные выравнивания были преобразованы в форматы UCSC ‘chain’ и ‘net’ с помощью axtChain (параметры: -minScore = 1000 -verbose = 0 -linearGap = medium), за которым следовали chainAntiRepeat, chainSort, chainPreNet, chainNet и netSyntenic, все с параметрами по умолчанию. 100 . Блоки парной синтении были определены с использованием maf2synteny 101 с разрешениями 100, 300 и 500 кб. Области эволюционных точек останова были обнаружены и классифицированы с использованием специального статистического подхода 102 .Этот анализ идентифицировал от 2 до 90 геномных областей на сборку, которые могли фланкировать неправильные сборки, хромосомные перестройки, специфичные для клонов, или референс-специфичные хромосомные перестройки (116 у человека и 26 у зебрового амадина). Для определения основной причины каждого из отмеченных регионов потребуется дополнительная проверка. Все сопоставления доступны для визуализации в браузере сравнительных хромосом Evolution Highway (http://eh-demo.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *